Архив автора

Thatcher и Walker (1969) изучили влияние фазы роста культуры на ее чувствительность к химиотерапевтическим препаратам. Было показано, что чувствительность активно растущей и стационарной культуры клеток хомячка к сернистому иприту, бисрхлорэтилнитрозомочевине и актиномицину D не различается. Индекс метки в культурах составлял 5060 и 1 соответственно. В стационарной культуре клетки задерживались в фазе G2. Авторы считают, что такая культура не моделирует различие в чувствительности быстро и медленно размножающихся клеток, обнаруженное Bruce с соавторами (1966, 1969) для таких препаратов.

В ряде работ обсуждалась роль потенциально летальных, повреждений при действии химиотерапевтических препаратов. Считается, что показателем наличия таких повреждений является изменение выживаемости клеток при изменении условий после воздействия препарата. Так, например, восстановление клеток лимфомы, обработанных диметилмилераном, усиливалось в результате инкубации клеток при температуре30 °С (Alexander, 1969). Результаты опытов Mauro и др. (1968) в культуре и Hahn с соавторами (1973) in vivo указывают, что в разных системах условия, в которых находятся клетки после действия препарата, влияют на их жизнеспособность. Неясным остается вопрос об отличии потенциально’ летальных от сублетальных повреждений. Два типа повреждений проявляются при действии разных факторов: потенциально летальное при действии неспецифических факторов (состав среды, температура), а сублетальное при действии препарата. Однако весьма возможно, что в обоих случаях разными методами обнаруживается одно и то же повреждение.

Была исследована также зависимость выжившей фракции от величины повторной дозы при введении ее через 3, 6 или 12 ч после введения 25 мг/кг. Плечо на кривой не обнаруживалось при интервале 3 ч, появлялось через 6 ч и увеличивалось через 12 ч. Эти данные соответствовали результатам, полученным при фракционировании доз: отсутствию репарации за 3 ч и эффективности вследствие этого малых доз, а также способности клеток вновь накапливать сублетальные повреждения через 612 ч. Таким образом, выживание клеток при повторных введениях препарата объяснялось действием двух факторов: репарации сублетальных повреждений и частичной синхронизацией выживших клеток в резистентной фазе цикла. Авторы указывают на другие объяснения наличия плеча на кривой дозаэффект, кроме сублетального повреждения: это может проявиться изза ограничения проницаемости клеточной мембраны или изза деградации активной формы препарата со скоростью, близкой к скорости активации, в результате чего при введении низких доз не достигается токсического уровня препарата. Против этих объяснений говорит отсутствие плеча на кривой дозаэффект при двукратном введении циклофосфамида с интервалом Зч.

Метод конечного разведения требует большого числа животных и длительного наблюдения, поэтому распространение получило определение выжившей фракции методом колоний, который лишен этих недостатков, хотя и является менее чувствительным. Метод колоний был разработан Bruce и Meeker (1964) на модели перевиваемой лимфомы мышей. Из костного мозга или селезенки мышей AKR с лимфомой путем механического измельчения получают взвесь изолированных клеток, которую вводят внутривенно сингенным здоровым мышам. Поскольку колонии из нормальных стволовых клеток образуются лишь в селезенке облученных реципиентов, метод учитывает только колонии опухолевых клеток. Через 8 дней после перевивки селезенку реципиентов фиксируют в растворе Буэна и подсчитывают число колоний. Количество колонииобразующих клеток не показывает абсолютного числа таких клеток во взвеси, так как лишь часть введенных клеток осаждается в селезенке. Введение 100400 клеток давало образование 1 колонии и, следовательно, 106 клеток содержало 2,5ХЮ3104 колонииобразующих единиц (КОЕ). Через 2 ч после введения опухолевых клеток 1,4 введенных КОЕ оседало в селезенке. Клетки, взятые из селезенки, при повторной перевивке не имели повышенного сродства к селезенке. Следовательно, в отношении сродства к селезенке популяция опухолевых клеток гомогенна и оседание в селезенке является случайным. Поскольку 1,4 введенных клеток обнаруживается в селезенке, то общее число КОЕ во взвеси в 70 раз больше, чем следует из числа колоний, образовавшихся в селезенке. Таким образом, 106 клеток лимфомы содержит 7ХЮ5 КОЕ и практическая каждая опухолевая клетка обладает способностью образовывать колонии. Добавление к взвеси опухолевых клеток большого числа нормальных кроветворных клеток не влияло на результаты титрования.

Гибель клеток в опухолях in vivo Детальные исследования гибели клеток в опухолях in vivo, особенно в солидных опухолях, относительно немногочисленны, несмотря на их огромную важность для понимания механизма действия химиотерапевтических препаратов. Поэтому эти работы будут изложены весьма подробно.
В ряде работ была детально изучена гибель клеток при действии циклофосфамида. Мышам с асцитной лейкемией L1210 циклофосфамид вводили подкожно через 24 ч после перевивки и выжившую фракцию определяли методом экстрополяции по увеличению числа клеток в брюшной полости (De Wys, Kight, 1969). На кривой дозаэффект наблюдалось плечо в результате того, что введение 612,5 мг/кг давало слабый эффект. Экспоненциальный участок характеризовался наличием начального компонента с D0 10 мг/кг,. перегибом между дозами 57 и 75 мг/кг и последующим участком с меньшим наклоном (D016 мг/кг). Такой перегиб указывает на наличие субпопуляций с различной чувствительностью. Начальный участок кривой характеризует поведениечувствительной субпопуляции, заключительный участок резистентной. Поскольку популяция асинхронна, негомогенность чувствительности можно объяснить ее колебанием в цикле. Плечо кривой дозаэффект указывало на наличие сублетальных повреждений, которые были детально изучены методом фракционирования доз. После однократного введе 40 ния 37,5 мг/кг и этой же суммарной дозы, введенной в два приема с интервалом 3 ч (25 и 12,5 мг/кг), выжившая фракция была одинакова. При интервале 6 ч выжившая фракция была в 2 раза больше при введении дробной дозы; при увеличении интервала различие еще не увеличивалось. Это показывает, что в течение 3 ч сублетальное повреждение остается фиксированным и через 6 ч и позже происходит его репарация. Если вводили две дозы по 25 мг/кг, то при интервале 6 ч выжившая фракция была такой же, как и после однократного введения и лишь при увеличении интервала происходило восстановление. Таким образом, чем больше была вторая доза, тем позже определялось начало репарации. Эти данные позволили рассчитать степень репарации. Выжившая фракция после введения 25 мг/кг составляет 21. Если выжившие клетки полностью восстанавливают сублетальное повреждение, то после второй такой же дозы выжившая фракция должна составлять 0,21X0,210,044 или 4,4. При полном отсутствии репарации выжившая фракция должна быть 1,7, как и после введения 50 мг/кг. Фактически выжившая фракция при интервале 12 ч составляла 7, что указывает на полную репарацию и, кроме того, на действие дополнительного фактора, повышающего резистентность выживших клеток. Авторы считают, что таким фактором является переход выживших клеток по циклу. Во время введения препарата выжившие клетки находятся в фазе цикла, наиболее резистентной к циклофосфамиду, и через 12 ч при tcll ч вновь вступают в эту фазу.