Архив рубрики «Использование»

В ряде работ выжившая фракция клеток в опухолях определялась по ‘колонииобразующей активности in vitro. В этих -опытах определялась эффективность посева (процент клеток, образующих колонии) в контроле и после воздействия и выжившая фракция рассчитывалась как отношение этих величин. Метод клонирования in vitro удобен, однако является достаточно чувствительным только при высокой эффективности посева в контроле, что не легко получить для опухолей, не адаптированных в культуре. Рядом авторов была получена высокая эффективность посева взвеси опухолевых клеток: 35 для рабдомиосаркомы крысы (Hermens, Barendson, 1969), 9299 для солидной и аецитной мастоцитомы (Hagemann е. а., 1973) и 1835 для саркомы мыши (Hahn е. а., 3973). В других работах эффективность посева была сущест 11 и колоний является удаление опухоли у леченого животного и введение взвеси изолированных клеток реципиенту. Это создает опасность модификации при обработке in vitro повреждения, полученного клетками при лечении in vivo. В результате этого клетки, оставшиеся in situ, могут вести себя иначе, чем клетки, перевитые другому животному. Конкретные примеры этого будут приведены ниже. Все же следует учитывать, что метод конечного разведения является наиболее чувствительным методом для определения выжившей фракции опухолевых клеток. При применении метода колоний, особенно метода колоний in vitro для опухолей, не адаптированных к культуре, может возникать сомнение в том, что одни и те же клетки способны к образованию колоний и к росту опухоли in situ. Возможно, лишь часть жизнеспособных клеток, особенно из леченой опухоли, будет образовывать колонии в культуре. При определении времени между введением препарата и взятием опухоли для титрования необходимо учитывать фармакологические данные, например время циркуляции препарата, возможность его повторного поступления из гибнущих клеток, вымывания препарата in vitro.

Метод колоний применяется не только при изучении лимфом, но и опухолей другого гистогенеза, причем колонии обычно возникают в легких. Van den Brenk с соавторами (1973а, б) вводили внутривенно крысам клетки перевиваемых аллогенных сарком. Метод в этом случае оказался чувствительным. Так, после введения 300 клеток реципиентам в возрасте 3 нед возникло 19 колоний. С увеличением возраста реципиента чувствительность метода резко падала. Было отмечено, что определенные воздействия существенно повышали выход колоний. При введении одновременно с опухолевыми клетками антилимфоцитарной сыворотки образовывалось 117 колоний на 300 клеток. Такая высокая клоногенность показывает, что значительная часть введенных клеток оседает в легких. Облучение реципиентов также увеличивало число колоний. Зависимость между логарифмом числа введенных клеток и логарифмом числа колоний была линейна. Таким образом, в оптимальных условиях (молодые реципиенты, подавление иммунитета) метод можно с успехом использовать для определения выжившей фракции, поскольку результат получается быстро и на небольшом числе животных. Интересно, что образование колоний стимулировалось локальным облучением легких при защите вилочковой железы. Очевидно, это является результатом увеличения эффективности посева опухолевых клеток в легких в результате индукции воспаления и пролиферации.

N колоний в селезенкехМ клеток/мл исходной взвеси NKOE/мл N введенных клеток 10 В контроле 10° млн. клеток содержали 194,5ХЮ3 КОЕ. Метод дает возможность определить число КОЕ на всю селезенку или костный мозг бедра и оценить изменения этого числа после различных воздействий. Этот метод не является высокочувствительным, поскольку для образования одной колонии необходимо введение приблизительно 500 клеток. Действительно, хотя после введения клеток селезенки от лейкозной мыши, леченной циклофосфамидом, колонии не образовывались, у части реципиентов развивался лейкоз.

Интерес представляет разработка метода колоний для лейкемии L1210, одной из наиболее распространенных экспериментальных моделей (Vadlamudi е. а., 1968). Опухоль, пассировали на мышах CDFb а в качестве реципиентов использовали мышей аллогенной линии BALB/c, титрование на которых давало наилучшие результаты. Вводили внутривенно 104 лейкозных клеток из селезенки или костного мозга в 0,2 мл 6 мышам и определяли число КОЕ в 1 мл исходной взвеси по следующей формуле:

Метод конечного разведения требует большого числа животных и длительного наблюдения, поэтому распространение получило определение выжившей фракции методом колоний, который лишен этих недостатков, хотя и является менее чувствительным. Метод колоний был разработан Bruce и Meeker (1964) на модели перевиваемой лимфомы мышей. Из костного мозга или селезенки мышей AKR с лимфомой путем механического измельчения получают взвесь изолированных клеток, которую вводят внутривенно сингенным здоровым мышам. Поскольку колонии из нормальных стволовых клеток образуются лишь в селезенке облученных реципиентов, метод учитывает только колонии опухолевых клеток. Через 8 дней после перевивки селезенку реципиентов фиксируют в растворе Буэна и подсчитывают число колоний. Количество колонииобразующих клеток не показывает абсолютного числа таких клеток во взвеси, так как лишь часть введенных клеток осаждается в селезенке. Введение 100400 клеток давало образование 1 колонии и, следовательно, 106 клеток содержало 2,5ХЮ3104 колонииобразующих единиц (КОЕ). Через 2 ч после введения опухолевых клеток 1,4 введенных КОЕ оседало в селезенке. Клетки, взятые из селезенки, при повторной перевивке не имели повышенного сродства к селезенке. Следовательно, в отношении сродства к селезенке популяция опухолевых клеток гомогенна и оседание в селезенке является случайным. Поскольку 1,4 введенных клеток обнаруживается в селезенке, то общее число КОЕ во взвеси в 70 раз больше, чем следует из числа колоний, образовавшихся в селезенке. Таким образом, 106 клеток лимфомы содержит 7ХЮ5 КОЕ и практическая каждая опухолевая клетка обладает способностью образовывать колонии. Добавление к взвеси опухолевых клеток большого числа нормальных кроветворных клеток не влияло на результаты титрования.