Май 2011

При всех методах определения выжившей фракции устанавливается число опухолевых клеток, вызывающих рост опухоли, гибель животного или образование колонии, в контроле и после введения препарата. Отношение числа живых клеток в контроле и опыте составляет величину выжившей фракции.
Метод конечного разведения был разработан Hewitt (1958) на модели перевиваемого лимфатического лейкоза мышей и затем применен для солидных и асцитных опухолей. Метод заключается во введении животным серийных разведений взвеси опухолевых клеток и состоит из следующих 9 основных этапов: 1) получения взвеси изолированных клеток; 2) серийного разведения взвеси; 3) введения каждого разведения животным; 4) учета результатов (Kallman е. а., 1967;. Hewitt е. а., 1967).

Следует подчеркнуть, что все эти методы основаны на определении способности клеток к размножению и что роль цитологических и гистологических методов при изучении гибели клеток весьма ограниченна. Было бы крайне важно научиться отличать цитологическими методами живые и по 8 гибшие опухолевые клетки. Однако в настоящее время это не представляется возможным, что затрудняет определение жизнеспособности клеток в опухолях человека и решение ряда важных вопросов, например установление зависимости жизнеспособности клетки от ее локализации в опухоли. Представляется маловероятным, что будут найдены цитологические методы определения выжившей фракции, поскольку формы гибели клеток весьма разнообразны. Клетки с различными формами распада ядер (кариорексис, кариопикноз) не являются живыми, и подсчет числа таких клеток в определенных случаях дает полезную информацию. Использование окраски эозином или трипановым синим для определения жизнеспособности клеток не является перспективным, так как этот метод дает ошибочные результаты. Так, Shirakawa и Frei (1970) показали, что в лейкемии L1210, леченной бис3хлорэтилнитрозомочевиной, выжившая фракция составляет при использовании методов биологического титрования и витальной окраски 0,1 и 20 соответственно. Goodman, Ackerman (1973) показали, что витальная окраска не обнаруживает гибели клеток лейкемии L1210 после инкубации их в среде с сарколизином, хлорамбуцилом, метотрексатом, 6меркаптопурином, актиномицином D и винбластином. Поскольку перечисленные препараты активны in vivo при лейкемии L1210, эти данные показывают, что метод витальной окраски не пригоден для определения цитотоксического действия химиотерапевтических препаратов. Drewinko, Gottlieb (1973) показали, что после воздействия адриамицином на культуру клеток лимфомы выжившая фракция составляла 0,001 при определении методом колоний и 38 при определении методом витальной окраски. Это еще раз подчеркивает неадекватность метода витальной окраски для изучения гибели опухолевых клеток. Очевидно, цитологическими методами определяются наиболее грубые и быстрые формы гибели клеток, сопровождающиеся распадом ядра и нарушением проницаемости. Поэтому многие авторы при подсчете числа вводимых опухолевых клеток исключают клетки, проницаемые для красителей, как определенно погибшие.

Исследование гибели клеток в культуре позволяет, с одной стороны, охарактеризовать действие препарата, а с другой свойства культуры. Эти характеристики проявляются, в кривых, описывающих зависимость выжившей фракции от дозы препарата и времени его действия. Анализ этих кривых позволяет выделить четыре группы препаратов: 1) для антиметаболитов и других соединений, действующих на синтез ДНК, характерны наличие насыщения в кривой дозаэффект, неэффективность кратковременных воздействий и замедление гибели клеток при длительном воздействии в результате выживания клеток с длительным циклом; 2) для воздействий, вызывающих гибель клеток в короткий период цикла, характерно нарастание гибели клеток со временем по мере их вступления в чувствительную фазу; 3) действие алкилирующих соединений характеризуется экспоненциальной кривой дозаэффект и в некоторых случаях наличием плеча на этой кривой; 4) при действии антибиотиков, связывающихся с ДНК, гибель клеток быстро нарастает по мере увеличения времени воздействия и кривая дозаэффект обычно двухфазна вследствие наличия чувствительной и резистентной субпопуляций.

Walker и Thatcher (1968) изучили репарацию сублетальных повреждений в культуре фибробластов L мыши после воздействия сернистого иприта. Значительное плечо в кривой дозаэффект указывало на наличие таких повреждений. При интервале между дозами 1530 мин выжившая фракция была меньше, при интервале 12 ч была равна, а при интервале 48 ч вновь была меньше, чем при однократной суммарной дозе. Таким образом, увеличение выжившей фракции, ожидаемое при репарации сублетальных повреждений, не обнаруживалось. Очень важные данные о закономерностях репарации были получены в этой работе при определении зависимости выжившей фракции от синтеза ДНК. Если препарат действовал на клетки в фазе S или непосредственно перед началом синтеза ДНК, то плечо в кривой дозаэффект не наблюдалось. При замедлении синтеза ДНК 5фтор2′дезоксиуридином на 4 ч после воздействия препарата или при действии препарата на клетки в фазе G2 в кривой наблюдалось отчетливое плечо. Это показывает, что для уменьшения 26 гибели реакция восстановления должна предшествовать синтезу ДНК и что после начала синтеза ДНК восстановления: не происходит. Walker и Thatcher (1968) считают, что в изученной ими модели имеет место репарация потенциально летальных, но не сублетальных повреждений, а это соответствует наличию плеча в кривой и отсутствию восстановления при фракционировании доз.

Mauro, Elkind (1968b) изучили репарацию сублетальных повреждений при действии сернистого иприта на клетки V79 хомячка методом фракционирования доз. Дозу 120 иг/мл разделяли на две (90+30). Если интервал между дозами был менее 1020 мин, то выжившая фракция была в 10 раз меньше, чем после однократного воздействия. Это показывает, что после первой дозы чувствительность клеток к препарату повышалась, так как при отсутствии репарации ожидалась. одинаковая величина выжившей фракции. При интервале между дозами 20 мин выжившая фракция равнялась таковой при однократном воздействии, а при интервале 2 ч значительно превышала ее, что указывает на репарацию сублетальных повреждений. При дальнейшем увеличении интервала выжившая фракция уменьшалась, очевидно, в результате перехода выживших клеток в чувствительную фазу цикла. Если клетки между двумя дозами находились при температуре 24°С, то репарация имела место в той же степени, что и при температуре 37 °С, но движения клеток по циклу и позднего увеличения чувствительности не происходило. Если затем клетки переносили в условия температуры 37°С, то увеличение чувствительности происходило с запаздыванием на время, равное пребыванию клеток при комнатной температуре.