09.05.2011

Метод конечного разведения требует большого числа животных и длительного наблюдения, поэтому распространение получило определение выжившей фракции методом колоний, который лишен этих недостатков, хотя и является менее чувствительным. Метод колоний был разработан Bruce и Meeker (1964) на модели перевиваемой лимфомы мышей. Из костного мозга или селезенки мышей AKR с лимфомой путем механического измельчения получают взвесь изолированных клеток, которую вводят внутривенно сингенным здоровым мышам. Поскольку колонии из нормальных стволовых клеток образуются лишь в селезенке облученных реципиентов, метод учитывает только колонии опухолевых клеток. Через 8 дней после перевивки селезенку реципиентов фиксируют в растворе Буэна и подсчитывают число колоний. Количество колонииобразующих клеток не показывает абсолютного числа таких клеток во взвеси, так как лишь часть введенных клеток осаждается в селезенке. Введение 100400 клеток давало образование 1 колонии и, следовательно, 106 клеток содержало 2,5ХЮ3104 колонииобразующих единиц (КОЕ). Через 2 ч после введения опухолевых клеток 1,4 введенных КОЕ оседало в селезенке. Клетки, взятые из селезенки, при повторной перевивке не имели повышенного сродства к селезенке. Следовательно, в отношении сродства к селезенке популяция опухолевых клеток гомогенна и оседание в селезенке является случайным. Поскольку 1,4 введенных клеток обнаруживается в селезенке, то общее число КОЕ во взвеси в 70 раз больше, чем следует из числа колоний, образовавшихся в селезенке. Таким образом, 106 клеток лимфомы содержит 7ХЮ5 КОЕ и практическая каждая опухолевая клетка обладает способностью образовывать колонии. Добавление к взвеси опухолевых клеток большого числа нормальных кроветворных клеток не влияло на результаты титрования.

Гибель клеток в опухолях in vivo Детальные исследования гибели клеток в опухолях in vivo, особенно в солидных опухолях, относительно немногочисленны, несмотря на их огромную важность для понимания механизма действия химиотерапевтических препаратов. Поэтому эти работы будут изложены весьма подробно.
В ряде работ была детально изучена гибель клеток при действии циклофосфамида. Мышам с асцитной лейкемией L1210 циклофосфамид вводили подкожно через 24 ч после перевивки и выжившую фракцию определяли методом экстрополяции по увеличению числа клеток в брюшной полости (De Wys, Kight, 1969). На кривой дозаэффект наблюдалось плечо в результате того, что введение 612,5 мг/кг давало слабый эффект. Экспоненциальный участок характеризовался наличием начального компонента с D0 10 мг/кг,. перегибом между дозами 57 и 75 мг/кг и последующим участком с меньшим наклоном (D016 мг/кг). Такой перегиб указывает на наличие субпопуляций с различной чувствительностью. Начальный участок кривой характеризует поведениечувствительной субпопуляции, заключительный участок резистентной. Поскольку популяция асинхронна, негомогенность чувствительности можно объяснить ее колебанием в цикле. Плечо кривой дозаэффект указывало на наличие сублетальных повреждений, которые были детально изучены методом фракционирования доз. После однократного введе 40 ния 37,5 мг/кг и этой же суммарной дозы, введенной в два приема с интервалом 3 ч (25 и 12,5 мг/кг), выжившая фракция была одинакова. При интервале 6 ч выжившая фракция была в 2 раза больше при введении дробной дозы; при увеличении интервала различие еще не увеличивалось. Это показывает, что в течение 3 ч сублетальное повреждение остается фиксированным и через 6 ч и позже происходит его репарация. Если вводили две дозы по 25 мг/кг, то при интервале 6 ч выжившая фракция была такой же, как и после однократного введения и лишь при увеличении интервала происходило восстановление. Таким образом, чем больше была вторая доза, тем позже определялось начало репарации. Эти данные позволили рассчитать степень репарации. Выжившая фракция после введения 25 мг/кг составляет 21. Если выжившие клетки полностью восстанавливают сублетальное повреждение, то после второй такой же дозы выжившая фракция должна составлять 0,21X0,210,044 или 4,4. При полном отсутствии репарации выжившая фракция должна быть 1,7, как и после введения 50 мг/кг. Фактически выжившая фракция при интервале 12 ч составляла 7, что указывает на полную репарацию и, кроме того, на действие дополнительного фактора, повышающего резистентность выживших клеток. Авторы считают, что таким фактором является переход выживших клеток по циклу. Во время введения препарата выжившие клетки находятся в фазе цикла, наиболее резистентной к циклофосфамиду, и через 12 ч при tcll ч вновь вступают в эту фазу.

При всех методах определения выжившей фракции устанавливается число опухолевых клеток, вызывающих рост опухоли, гибель животного или образование колонии, в контроле и после введения препарата. Отношение числа живых клеток в контроле и опыте составляет величину выжившей фракции.
Метод конечного разведения был разработан Hewitt (1958) на модели перевиваемого лимфатического лейкоза мышей и затем применен для солидных и асцитных опухолей. Метод заключается во введении животным серийных разведений взвеси опухолевых клеток и состоит из следующих 9 основных этапов: 1) получения взвеси изолированных клеток; 2) серийного разведения взвеси; 3) введения каждого разведения животным; 4) учета результатов (Kallman е. а., 1967;. Hewitt е. а., 1967).

Следует подчеркнуть, что все эти методы основаны на определении способности клеток к размножению и что роль цитологических и гистологических методов при изучении гибели клеток весьма ограниченна. Было бы крайне важно научиться отличать цитологическими методами живые и по 8 гибшие опухолевые клетки. Однако в настоящее время это не представляется возможным, что затрудняет определение жизнеспособности клеток в опухолях человека и решение ряда важных вопросов, например установление зависимости жизнеспособности клетки от ее локализации в опухоли. Представляется маловероятным, что будут найдены цитологические методы определения выжившей фракции, поскольку формы гибели клеток весьма разнообразны. Клетки с различными формами распада ядер (кариорексис, кариопикноз) не являются живыми, и подсчет числа таких клеток в определенных случаях дает полезную информацию. Использование окраски эозином или трипановым синим для определения жизнеспособности клеток не является перспективным, так как этот метод дает ошибочные результаты. Так, Shirakawa и Frei (1970) показали, что в лейкемии L1210, леченной бис3хлорэтилнитрозомочевиной, выжившая фракция составляет при использовании методов биологического титрования и витальной окраски 0,1 и 20 соответственно. Goodman, Ackerman (1973) показали, что витальная окраска не обнаруживает гибели клеток лейкемии L1210 после инкубации их в среде с сарколизином, хлорамбуцилом, метотрексатом, 6меркаптопурином, актиномицином D и винбластином. Поскольку перечисленные препараты активны in vivo при лейкемии L1210, эти данные показывают, что метод витальной окраски не пригоден для определения цитотоксического действия химиотерапевтических препаратов. Drewinko, Gottlieb (1973) показали, что после воздействия адриамицином на культуру клеток лимфомы выжившая фракция составляла 0,001 при определении методом колоний и 38 при определении методом витальной окраски. Это еще раз подчеркивает неадекватность метода витальной окраски для изучения гибели опухолевых клеток. Очевидно, цитологическими методами определяются наиболее грубые и быстрые формы гибели клеток, сопровождающиеся распадом ядра и нарушением проницаемости. Поэтому многие авторы при подсчете числа вводимых опухолевых клеток исключают клетки, проницаемые для красителей, как определенно погибшие.

Исследование гибели клеток в культуре позволяет, с одной стороны, охарактеризовать действие препарата, а с другой свойства культуры. Эти характеристики проявляются, в кривых, описывающих зависимость выжившей фракции от дозы препарата и времени его действия. Анализ этих кривых позволяет выделить четыре группы препаратов: 1) для антиметаболитов и других соединений, действующих на синтез ДНК, характерны наличие насыщения в кривой дозаэффект, неэффективность кратковременных воздействий и замедление гибели клеток при длительном воздействии в результате выживания клеток с длительным циклом; 2) для воздействий, вызывающих гибель клеток в короткий период цикла, характерно нарастание гибели клеток со временем по мере их вступления в чувствительную фазу; 3) действие алкилирующих соединений характеризуется экспоненциальной кривой дозаэффект и в некоторых случаях наличием плеча на этой кривой; 4) при действии антибиотиков, связывающихся с ДНК, гибель клеток быстро нарастает по мере увеличения времени воздействия и кривая дозаэффект обычно двухфазна вследствие наличия чувствительной и резистентной субпопуляций.